Efficiency of Denitrifying Phosphorus Removal and Population Dynamics of Candidatus Accumulibacter in MUCT
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摘要:
以处理实际生活污水的连续流MUCT工艺为基础，探究了全程硝化和短程硝化状态下优势聚磷菌Candidatus Accumulibacter的群落动态与系统反硝化除磷效果之间的相互联系.流式细胞仪定量检测结果表明，系统中聚磷菌占全菌的比例为22.1%，Accumulibacter是处于全程硝化状态下的优势聚磷菌，对系统中氮磷的去除起到重要作用.qPCR定量结果表明，短程硝化状态下的优势种IIC和IIC（ppk1 excluding OTU NS D3）以及IIF的增长率较快，占总Accumulibacter比例分别为11.53%、34.31%和17.97%，其利用亚硝进行反硝化除磷的能力比其他分支强，对系统化中亚硝的去除起到重要作用.IID分支在反应器整个运行阶段一直处于优势地位，是系统内氮磷去除最重要的分支.其在全程硝化状态下占Accumulibacter分支总和的80%，但在短程状态下的竞争能力不如其他的TypeII型分支.
Abstract:In this study, Modified University of Cape Town (MUCT) process was used to treat domestic sewage with low ρ(C)/ρ(N) ratio, and the relationship between population dynamics of dominant Candidatus Accumulibacter and efficiency of denitrifying phosphorus removal under nitration and nitrification was studied. Flow cytometry based quantification showed that Accumulibacter accounting for 22.1% of total bacteria were dominant phosphate accumulating organisms (PAOs) in system under nitrification. qPCR based estimation indicated that dominant species IIC, IIC(ppk1 excluding OTU NS D3) and IIF grew fast and accounted for 11.53%, 34.31% and 17.97% of Accumulibacter, respectively, while their ability using nitrite to achieve denitrifying phosphorus removal were stronger than that of other clades and were important for nitrite removal in system. As the most important clade in N and P removal in system, IID was always dominant along entire operation, which accounted for 80% of Accumulibacter under nitrification, but not as competitive as other Type Ⅱ clades under nitration.
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富含氮、磷污染物的污废水的过量排放是导致水体富营养化的主要原因[1].因此，排放污水中含有的氮和磷如何被有效去除成了亟待解决的问题.强化生物除磷工艺(enhanced biological phosphorus removal，EBPR)由于其经济高效、环保可持续的特点，现已被广泛应用于全球各地.然而到目前为止，这种经济、高效的处理工艺仍然会出现难以预测和解释的除磷效果恶化的现象.因此，有必要对除磷功能微生物的结构组成和代谢活动进行深入研究，为污水处理工艺的正常高效运行提供理论依据.在EBPR中，与磷的去除紧密相关联的微生物种群被称之为聚磷菌(polyphosphate accumulating organisms，PAOs).这些微生物能够将水中离子态的磷酸盐储存为胞内多聚磷酸盐颗粒，同时合成自身生长繁殖所需的各种含磷物质.通过排泥的方式，去除过量吸磷的聚磷微生物，从而达到除磷的效果[2].
虽然有研究表明，在污水处理系统中也存在具有PAOs的生理特性并具有生物除磷功能的其他菌群，比如Microlunatus phosphovorus[3]、Actinobacteria[4-5]、Purple nonsulfur bacteria[6]、Tetrasphaera[7]等，但是，有研究指出，无论是实验室规模还是生产规模的EBPR系统中，隶属于Beta-proteobacteria中的Rhodocyclus Group都是占主导地位的除磷微生物，被命名为“Candidatus Accumulibacter phosphatis”[8-10].已有文献报道，Candidatus Accumulibacter包含Type Ⅰ和Type Ⅱ两种类型，其中Type Ⅰ型含有5个分支，Type Ⅱ含有9个分支，共计14个分支菌属[11-13].由于Candidatus Accumulibacter的菌群结构及其分支的动态变化影响着实际污水处理工艺的脱氮除磷效果，该菌属及其分支已经成为目前城市生活污水处理领域应用最广且研究最深入的一类聚磷菌.
本研究旨在探讨分析在不同硝化模式下，以处理实际生活污水的MUCT工艺中反硝化除磷效率与优势聚磷菌Candidatus Accumulibacter的菌群动态变化之间的相互联系作为理论支撑，为实际污水处理工艺的调控运行提供理论基础，指导污水处理厂工艺的高效稳定运行.
1. 材料和方法
1.1 试验装置与运行
本研究所采用的连续流装置为MUCT工艺，反应器装置如图 1所示.整个反应器由反应区和二沉池两部分组成，材质为有机玻璃.其中反应区有效体积为73.92 L，通过溢流的方式，各反应区的水流入下一反应区内；二沉池有效体积为24 L，采用中间进水周边出水的方式进行排水.反应区主要分为5个格室，第1个格室为厌氧区，第2、3个格室为缺氧区，第4、5个格室为好氧区.各反应区的体积比约为V厌氧:V缺氧1:V缺氧2:V好氧2=1:1:3:3.
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图 1 连续流MUCT实验装置1—原水箱; 2—蠕动泵; 3—进水; 4—电动搅拌器; 5—厌氧区; 6—缺氧1区; 7—缺氧2区; 8—好氧区; 9—转子流量计; 10—空气压缩机; 11—DO测定仪; 12—曝气头; 13—二沉池; 14—出水; 15—污泥回流; 16—硝化液回流; 17—缺氧回流; 18—剩余污泥.Figure 1. Schematic diagram of MUCT process试验所用生活污水主要来自于北京工业大学家属小区的生活污水，通过水泵将小区化粪池内的生活污水泵入进水水箱进行沉淀和贮存，水箱注水体积为270 L.进水、缺氧区回流、硝化液回流和污泥回流都由蠕动泵控制.通过搅拌器搅拌将各个格室内的泥水混合均匀.气温降低时，通过放置在各个区室的温控加热装置将温度控制在(25±2)℃.好氧区曝气量由连接在曝气泵的转子流量计控制，通过DO和pH测定仪(WTW 3410)测定水中的DO和pH.反应器进水首先由蠕动泵控制泵入厌氧区，二沉池回流污泥进入缺氧一区回流比为R1，利用缺氧区的反硝化作用来减少回流污泥中含有的硝态和亚硝态氮，降低对厌氧区释磷的影响；缺氧一区回流至厌氧区，回流比为R2；好氧区硝化液回流至好氧二区，回流比为R3.反应器沿程亚硝的积累率$\frac{{\rho \left( {{\rm{NO}}_2^ - - {\rm{N}}} \right)}}{{\rho \left( {{\rm{NO}}_2^ - - {\rm{N}}} \right) + \rho \left( {{\rm{NO}}_3^ - - {\rm{N}}} \right)}}$，式中ρ(NO2--N)为反应器泥水混合物溶液中亚硝酸盐的质量浓度(mg/L)，ρ(NO3--N)为反应器泥水混合物溶液中硝酸盐的质量浓度(mg/L).通常根据该式来表征反应器中亚硝酸盐的积累率大小，从而据此判定分析反应器所处的硝化状态.
本研究中MUCT的运行数据来自于反应器启动运行第20天至第270天的实验数据，总共250天.根据反应器不同的运行参数，将反应周期划分为5个阶段，以实现全程硝化向短程硝化的转变，并探究每一阶段对应的不同硝化状态下系统的反硝化除磷效率与优势聚磷菌Candidatus Accumulibacter菌群动态之间的相互联系.具体运行方式见表 1.
表 1 MUCT运行参数Table 1. Experimental scheme of MUCT process treating domestic wastewater阶段 进水流量/(L·h-1) 水力停留时间/h 污泥回流比R1/% 缺氧回流比R2/% 硝化液回流比R3/% ρ(DO)/(mg·L-1) 污泥龄/d Ⅰ (第20天—第61天) 6.16 12 100 100 200 2 30±5 Ⅱ (第62天—第104天) 6.16 12 100 100 250 2 30±5 Ⅲ (第105天—第151天) 6.16 12 80 100 300 2 30±5 Ⅳ (第152天—第206天) 7.39 10 100 100 300 2 30±5 Ⅴ (第207天—第270天) 7.39 10 100 100 250 2 30±5 1.2 实验用水和种泥
试验用水来自北京工业学大学家属院化粪池的生活污水，属于典型的低碳氮比城市生活污水，具体水质指标见表 2.
表 2 进水水质Table 2. Characteristics of the raw wastewater检测项目 范围 平均值 ρ(COD)/(mg·L-1) 48.55~310.60 179.58 ρ(NH4+-N)/(mg·L-1) 31.50~94.72 67.04 ρ(NO2--N)/(mg·L-1) 0~0.10 0.005 ρ(NO3--N)/(mg·L-1) 0.06~0.15 0.11 ρ(TN)/(mg·L-1) 31.56~94.87 71.22 ρ(PO43--P)/(mg·L-1) 1.42~13.60 6.29 ρ(C)/ρ(N) 0.86~3.38 2.68 pH 7.13~7.42 7.26 种泥取自于北京市小红门污水处理厂A2O工艺二沉池回流污泥，属于典型的全程硝化模式下的污泥，脱氮除磷效果良好.
1.3 分析测定方法
1.3.1 常规水质测定
试验水样先经0.45 μm中性滤纸过滤，水样中COD、PO43--P、MLSS、MLVSS依据标准方法进行分析检测[14]，DO和pH使用WTW(Multi 3410, WTW, Germany)在线检测.
1.3.2 流式细胞仪
取固定好的样品，冰水浴超声6 min，超声强度为40%，细胞浓度大约为1×108/mL.离心去除上清液，依次加入50%、80%、99%的乙醇各脱水3 min.将5′端含有Cy5标记的探针PAO462、PAO651和PAO846(PAO846:PAO651:PAO462体积比为1:1:1)用于“Ca. Accumulibacter phosphatis”杂交[15].杂交缓冲液含有35%甲酰胺、0.9 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, 0.01% SDS.将脱水后细胞重悬于探针杂交缓冲液中超声1 min，46 ℃恒温培养箱中杂交140 min.离心去除上清液，加入PBS清洗杂交细胞2次，再次加入1 mL PBS稀释.稀释后超声1 min，经10 μm滤膜过滤.加入10 μL 100× SYBR GREEN I常温下对全菌DNA染色15 min.
FISH/SYBR Green I双重标记处理后的细胞，经流式细胞仪(BD AccuriTM C6)进行上机检测分析，上机样品检测分析前10 000×稀释，使每管中细胞浓度为1×104~1×105/mL；流式数据使用FlowJo V10软件圈门定量分析细菌细胞.
1.3.3 DNA的提取以及实时荧光定量PCR
使用Fast DNA SPIN kits for soil (Bio 101, Vista, CA, USA)试剂盒提取冻干后反应器中污泥的细菌基因组DNA.实时定量PCR用于定量全菌16s rRNA、聚磷菌16s rRNA以及Accumulibacter各分支菌种IA、IIA、IIB、IIC、IIC(ppk1 excluding OTU NS D3)、IID、IIF.特异性引物和相关qPCR程序如表 3所示.使用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq kit试剂盒，混合体系总体积为25 μL，包括12.5 μL SYBR Premix Ex Taq buffer (2-fold)，1 μL正向引物(10 mM)，1 μL反向引物(10 mM)，0.5 μL ROX Reference Dye Ⅱ (50-fold)，2 μL DNA质粒模版和8 μL无菌水.
表 3 qPCR扩增程序及特异性引物Table 3. Specific primer sequences and programs of qPCR in this study引物 序列 目标基因 基因片段长度/bp 扩增程序 参考文献 1055F ATGGCTGTCGTCAGCT Bacterial 16S rRNA 323 95 ℃ 10 min; 45 cycles of 30 s of 95 ℃, 60 s at 50 ℃, 20 s at 72 ℃ [16] 1392R ACGGGCGGTGTGTAC 518f CCAGCAGCCGCGGTAAT Acc 16S rRNA genes 351 95 ℃ 3 min; 35 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 60 ℃, 30 s at 72 ℃[17] PAO-846r GTTAGCTACGGCACTAAAAGG Acc-ppk1-763f GACGAAGAAGCGGTCAAG Acc-IA 408 95 ℃ 3 min; 45 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 61 ℃, 30 s at 72 ℃[17] Acc-ppk1-1170r AACGGTCATCTTGATGGC Acc-ppk1-893f AGTTCAATCTCACCGAGAGC Acc-IIA 105 95 ℃ 3 min; 45 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 61 ℃, 30 s at 72 ℃[17] Acc-ppk1-997r GGAACTTCAGGTCGTTGC Acc-ppk1-870f GATGACCCAGTTCCTGCTCG Acc-IIB 133 95 ℃ 3 min; 45 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 61 ℃, 30 s at 72 ℃[17] Acc-ppk1-1002r CGGCACGAACTTCAGATCG Acc-ppk1-254f TCACCACCGACGGCAAGAC Acc-IIC 207 95 ℃ 3 min; 45 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 66 ℃, 30 s at 72 ℃[17] Acc-ppk1-460r CCGGCATGACTTCGCGGAAG Acc-ppk1-1123f GAACAGTCCGCCAACGACC Acc-IIC (ppk1 excludingOTU NS D3) 254 95 ℃ 3 min; 45 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 63 ℃, 30 s at 72 ℃[17] Acc-ppk1-1376r ACGATCATCAGCATCTTGGC Acc-ppk1-375f GGGTATCCGTTTCCTCAAGCG Acc-IID 148 95 ℃ 3 min; 45 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 63 ℃, 30 s at 72 ℃[17] Acc-ppk1-522R GAGGCTCTTGTTGAGTACACGC Acc-ppk1-355f CGAACTCGGCGAAAGCGAGTA Acc-IIF 246 95 ℃ 3 min; 35 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 70 ℃, 30 s at 72 ℃[18] Acc-ppk1-600R ATCGCCTCCGAGCAACTGTTC 2. 结果与讨论
2.1 反应器运行状况
反应器运行根据参数的调整情况，分为总共5个阶段.其中，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ阶段属于全程硝化状态，平均亚硝积累率较低.第Ⅰ阶段亚硝基本为零，属于完全硝化状态.第Ⅱ、Ⅲ阶段末亚硝质量浓度稍有上升，属于全程硝化向短程硝化转变的过渡阶段.第Ⅳ阶段平均NAR=75.09%，其属于短程硝化反硝化阶段.第Ⅴ阶段是从第Ⅳ阶段短程硝化向全程硝化调整，其亚硝积累率总体偏低，好氧二区的硝氮质量浓度相对较高.亚硝积累情况具体如图 4所示.
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图 4 好氧区NO3--N和NO2--N的质量浓度以及亚硝积累率Figure 4. Variations of NO3--N, NO2--N concentrations and nitrite Accumulation rates in the aerobic zone第Ⅰ阶段，进水流量为6.16 L/h，水力停留时间HRT为12 h，溶解氧DO质量浓度控制在2 mg/L左右，如图 4所示，好氧区亚硝几乎为零，硝氮平均质量浓度为22.14 mg/L，整个阶段属于典型的全程硝化反硝化除磷，进水中含有的NH4+-N平均质量浓度为71 mg/L，COD平均质量浓度为200 mg/L左右，属于常见的低ρ(C)/ρ(N)城镇生活污水.从图 2可以看出，在阶段Ⅰ的运行过程中，厌氧区的释磷量一直处于上升状态，这表明此种状态下反应器的运行有利于提高聚磷菌的活性，且在缺氧区出水的磷基本能被有效地去除，系统的反硝化除磷效果良好. 图 2中，第Ⅰ阶段NH4+-N去除率保持在95%以上，出水NH4+-N在5 mg/L以下，去除效率高.阶段Ⅱ，将硝化液回流比调整为250%，反应器的实际水力停留时间减小，好氧区的实际水力停留时间缩短.虽然进水NH4+-N质量浓度和去除效率都有所波动，但总体NH4+-N去除效率较好，厌氧区的释磷量总体呈现出升高的趋势.可以认为该阶段属于半短程阶段，并且有部分亚硝的积累，且硝氮质量浓度逐步下降，NAR有升高的趋势.由此可以看出，经过一段时间的运行，MUCT反应器在进水负荷波动比较大的情况下，在缺氧区依然能保持较好的脱氮除磷效率，且其抗负荷冲击能力逐步增强.阶段Ⅲ进一步增大硝化液回流比为300%，同时污泥回流调整为80%，在这时段运行时间内，进水NH4+-N质量浓度依旧比较波动，由于硝化液回流比的增大，回流硝化液中含有的溶解氧同时也使得厌氧区的溶解氧也升高，进而影响了磷的释放.如图 4所示，由于阶段Ⅲ释磷量下降的影响，使得好氧区硝氮质量浓度较之前升高.在后续的运行过程中，系统逐渐适应该种运行模式，硝氮质量浓度逐渐降低，亚硝质量浓度缓慢上升，NAR逐渐也随之升高，反应器由全程硝化阶段向短程硝化阶段过渡，且系统依旧保持高效的反硝化除磷效率.
阶段Ⅳ，进水流速调整为7.39 L/h，好氧区的平均NAR达到了75%，反应器进入了短程硝化反硝化脱氮除磷状态.如图 4所示，在第152天—第206天期间，硝氮基本被亚硝所取代，氨氮的氧化停留在了亚硝阶段，使得好氧区的脱氮除磷的电子受体只有亚硝.从图 3中可以看出，厌氧磷的释放有所下降，但是基本趋于稳定，平均释磷质量浓度为25.0 mg/L，经缺氧区的反硝化除磷作用后，磷质量浓度能降到平均10.0 mg/L以下，继而经好氧区吸磷以后能降到平均3.7 mg/L左右.在短程阶段，出水中含有的亚硝长期运行对反应器的运行效果产生了负面效果，对整体的脱氮除磷效果起到了抑制作用，在阶段Ⅳ末期，亚硝积累率逐渐降低，厌氧区的硝氮逐渐升高，系统由短程硝化逐渐在向全程硝化发生转变，此时处于末期的氨氮出水含量较高，去除效率不佳.在阶段V，将回流比调整为250%.反应器的实际水力停留时间减少，提高硝氮的积累率，有利于反应器向全程的转变.
2.2 qPCR与流式细胞仪对MUCT中聚磷菌的定量检测分析
流式细胞仪(flow cytometry)的定量结果如图 5所示.对取自MUCT反应器运行第120天，即第Ⅲ阶段全程硝化状态下的污泥泥样进行聚磷菌的定量分析.通过FISH杂交及SYBR GREEN I染色对该阶段污泥样本进行标记，并由流式细胞仪对其进行定量检测分析.针对本实验的样品检测，主要使用的是分析型流式细胞仪BD AccuriTM C6，其配置的20 mW 488 nm蓝色激光器用于激发SYBR GREEN I荧光染料. SYBR GREEN I是一种不对称花青素染料，其最大激发波长为λmax=497 nm，最大发射波长为λmax=520 nm，用于全菌双链DNA的检测，以区别于背景噪音.另外一根14.7 mW 640 nm红色激光器用于激发探针上标记的Cy5. Cy5最大激发波长为λmax=647 nm，最大发射波长为λmax=662 nm，用于目标菌“Ca. Accumulibacter phosphatis”探针杂交的标记检测.
通过选取横、纵坐标轴参数FITC:SYBR GREEN以及APC-A:Cy5，十字象限门中Q2区域显示双阳比例为22.1%，即处于全程硝化状态下的MUCT工艺中PAOs占全菌的比例为22.1%.
图 6给出了实时荧光定量qPCR的定量结果.从图中可知，MUCT运行第120天时，单位质量污泥中含有的Accumulibacter各分支组成丰度分别为6.68×106 cells/g (IA)、9.67×108 cells/g (IIA)、5.14×108 cells/g (IIB)、5.28×108 cells/g(IIC)、1.74×109 cells/g (IIC(ppk1 excluding OTU NS D3))、2.07×1010 cells/g (IID)、1.03×109 cells/g (IIF).而PAO 16S rRNA的拷贝数为5.65×1010 copies/g，有研究者认为，聚磷菌单个细胞中含有2拷贝的操纵子[17, 19]，据此，将测得的PAO 16S rRNA的拷贝数折算为细胞浓度后为2.83×1010 cells/g.此外，测得的全菌的丰度为8.28×1011 copies/g，由于关于单个细菌细胞体内含有的16S rRNA的数量存在争议，本研究将其具有争议的数量都考虑进去，即得到折算后全菌的细胞丰度分别为2.3×1011 cells/g (3.6 copies/cell)[20]和2.02×1011 cells/g (4.1 copies/cell)[17].从而计算得到PAOs的全菌含量占比分别为12.3%和14.01%.并由图 6可知，所有Accumulibacter分支之和占据PAO的比例为90.1%，表明Accumulibacter是反应器所有聚磷菌中的优势菌属.
基于qPCR针对MUCT反应器中运行第120天泥样定量检测，全菌中PAOs的定量分析占比分别为12.3%和14.01%，依赖于Flow cytometry技术的流式细胞仪检测结果为22.1%.由于流式细胞仪检测的高灵敏度，流式定量的结果通常会高于qPCR的定量结果.二者的定量结果存在一定的差异，但依赖于流式细胞仪检测的结果的稳定性以及高灵敏度，流式细胞检测方法依然能满足对PAOs定量的要求.检测结果表明，在该连续流反硝化除磷系统中，Accumulibacter是处于全程硝化状态下的优势聚磷菌.
2.3 MUCT工艺脱氮除磷性能与Accumulibacter各分支动态变化分析
本章研究内容选取了整个运行周期的前4个阶段的泥样进行了DNA的提取和实时荧光定量检测，其中阶段Ⅰ和阶段Ⅲ的取样时间点均在系统处于完全的全程硝化阶段，此时亚硝积累率NAR为0.阶段Ⅱ的取样时间点为系统处于半短程阶段.从图 4可以看出，此时存在有部分的亚硝积累率，而亚硝积累的存在可能会对反应器中的微生物菌群的群落结构造成各种难以预测的影响结果. qPCR定量结果如图 7所示.从图中可知，单位质量污泥中IA分支的最高丰度是第Ⅰ阶段的4.162×107 cells/g，占所测得的Accumulibacter所有分支总和的0.29%，此后IA的丰度一直处于下降的状态，其占比非常低且处于逐渐下降的趋势，属于被淘汰的分支菌属.先前的研究认为IA分支具备有能利用NO3--N的能力，能以NO3--N作为电子受体进行吸磷，而NO3--N的减少不利于IA生存[21-22]，这与本研究中的现象是一致的.分支IIA的含量占整个Accumulibacter的含量并不高，在整个运行过程中，第Ⅳ阶段占比达到最高5.59%，属于非优势菌，但其变化趋势却表现出对短程阶段的偏向性，即在第Ⅰ和第Ⅲ阶段，处于完全硝化阶段，比例有所降低，当处于半短程的第Ⅱ以及短程硝化的第Ⅳ阶段时，其比例稍有上升，但由于其占比都低于6%，对系统的脱氮除磷过程起不到决定性的作用.
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图 7 反应器沿程各阶段Accumulibacter分支的丰度变化Figure 7. Variations of Acc clades along the reactor in MUCT process at different experimental stages先前有关于Accumulibacter的宏基因组学研究结果表明，分支IIA具有亚硝酸还原酶基因，但是不存在硝酸盐还原酶基因.而分支IA具备有还原硝酸盐的功能酶基因.这一研究结论很好地解释了IIA可以还原亚硝酸盐而不能还原硝酸盐[19].
同样类似于IIA分支，另一分支IIB的丰度占比以及变化情况基本与IIA相同，占比较低，且在有亚硝存在的情况下，丰度有所增长，最高生物量能达到109数量级.相比之下，IIC以及IIC(ppk1 excluding OTU NS D3)两分支的变化比较明显，但变化趋势依然和IIA、IIB的变化趋势类似.在有亚硝存在的半短程和短程阶段，IIC和IIC(ppk1 excluding OTU NS D3)的增幅量很明显，且后者的占比相较于前者要高，微生物增长量要快，体现出更强的竞争能力.这说明IIC(ppk1 excluding OTU NS D3)对亚硝的利用能力更强，对系统中亚硝的去除起到了重要的作用.在第Ⅱ阶段，单位质量污泥中IIC和IIC(ppk1 excluding OTU NS D3)的丰度分别为5.84×109 cells/g和2.45×1010 cells/g，占比分别为6.93%和29.02%.到第Ⅳ阶段，短程硝化模式下，二者丰度分别为1.60×1010 cells/g和4.77×1010 cells/g，占比分别达到了11.53%和34.31%，表现出对亚硝的偏好，以及更强的竞争能力，成为系统中的优势聚磷菌属，并且能有效地去除系统中的亚硝.
分支IID作为优势菌一直存在于系统中，且几乎是处于绝对优势的细菌，但在第Ⅱ和第Ⅳ阶段对应的半短程和短程阶段，其丰度稍有下降，占所测得的Accumulibacter的比例也有所下降，从硝化阶段的绝对优势菌种变成了与其他菌种并存的优势种.由此可见，可能是由于IID分支对以亚硝为电子受体的利用没有其他菌种的竞争能力强，如IIC、IIC(ppk1 excluding OTU NS D3)和IIF.这导致了其他分支逐渐增长，IID分支占比降低.然而，在全程硝化阶段下，IID分支体现出了对硝氮的利用能力比其他分支强.同时在短程阶段也表现出了对亚硝的耐受性，即自身对亚硝的利用能力的存在，只不过对亚硝的利用能力不如其他的分支菌种.分支IIF如同其他的Type Ⅱ型菌种一样，表现出短程硝化亚硝存在状态下的偏向，在第Ⅳ阶段其丰度达到最高点2.50×1010 cells/g，占定量的所有Accumulibacter分支总和的17.97%，其体现出了以亚硝为电子受体的反硝化除磷能力.
3. 结论
1) 全程硝化状态下，NH4+-N去除率保持在95%以上，缺氧区磷能被有效地去除，系统的反硝化除磷效果良好；短程硝化状态下，厌氧区释磷量有所下降，好氧区的亚硝积累率NAR平均值达75%，氨氮去除率在90%以上.
2) 分支IID在全程硝化状态下占所有Accumulibacter分支总和的90%以上，是系统中的优势分支.分支IIC和IIC(ppk1 excluding OTU NS D3)以及IIF增长率较快，是短程状态下的优势种；IID分支在短程状态下的占比为27%，竞争优势不如其他分支.
3) 基于qPCR的检测结果表明，TypeII型Accumulibacter分支中除了IID外，其他分支都表现出了对存在亚硝的短程硝化模式的偏向性，即短程硝化有利于II型分支的富集，这表明II型分支对系统化中亚硝的去除起到重要作用. IIC和IIC(ppk1 excluding OTU NS D3)以及IIF作为短程状态下的优势菌种，其利用亚硝进行反硝化脱氮的能力比其他分支强. IID分支作为全程状态下的优势种，对系统中硝氮的去除至关重要；短程硝化状态下IID分支竞争能力不如其他分支，但是作为优势种，是系统整个运行过程中氮磷去除最重要的分支.
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图 1 连续流MUCT实验装置
1—原水箱; 2—蠕动泵; 3—进水; 4—电动搅拌器; 5—厌氧区; 6—缺氧1区; 7—缺氧2区; 8—好氧区; 9—转子流量计; 10—空气压缩机; 11—DO测定仪; 12—曝气头; 13—二沉池; 14—出水; 15—污泥回流; 16—硝化液回流; 17—缺氧回流; 18—剩余污泥.
Figure 1. Schematic diagram of MUCT process
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图 4 好氧区NO3--N和NO2--N的质量浓度以及亚硝积累率
Figure 4. Variations of NO3--N, NO2--N concentrations and nitrite Accumulation rates in the aerobic zone
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图 7 反应器沿程各阶段Accumulibacter分支的丰度变化
Figure 7. Variations of Acc clades along the reactor in MUCT process at different experimental stages
表 1 MUCT运行参数
Table 1 Experimental scheme of MUCT process treating domestic wastewater
阶段 进水流量/(L·h-1) 水力停留时间/h 污泥回流比R1/% 缺氧回流比R2/% 硝化液回流比R3/% ρ(DO)/(mg·L-1) 污泥龄/d Ⅰ (第20天—第61天) 6.16 12 100 100 200 2 30±5 Ⅱ (第62天—第104天) 6.16 12 100 100 250 2 30±5 Ⅲ (第105天—第151天) 6.16 12 80 100 300 2 30±5 Ⅳ (第152天—第206天) 7.39 10 100 100 300 2 30±5 Ⅴ (第207天—第270天) 7.39 10 100 100 250 2 30±5 
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表 2 进水水质
Table 2 Characteristics of the raw wastewater
检测项目 范围 平均值 ρ(COD)/(mg·L-1) 48.55~310.60 179.58 ρ(NH4+-N)/(mg·L-1) 31.50~94.72 67.04 ρ(NO2--N)/(mg·L-1) 0~0.10 0.005 ρ(NO3--N)/(mg·L-1) 0.06~0.15 0.11 ρ(TN)/(mg·L-1) 31.56~94.87 71.22 ρ(PO43--P)/(mg·L-1) 1.42~13.60 6.29 ρ(C)/ρ(N) 0.86~3.38 2.68 pH 7.13~7.42 7.26
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表 3 qPCR扩增程序及特异性引物
Table 3 Specific primer sequences and programs of qPCR in this study
引物 序列 目标基因 基因片段长度/bp 扩增程序 参考文献 1055F ATGGCTGTCGTCAGCT Bacterial 16S rRNA 323 95 ℃ 10 min; 45 cycles of 30 s of 95 ℃, 60 s at 50 ℃, 20 s at 72 ℃ [16] 1392R ACGGGCGGTGTGTAC 518f CCAGCAGCCGCGGTAAT Acc 16S rRNA genes 351 95 ℃ 3 min; 35 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 60 ℃, 30 s at 72 ℃[17] PAO-846r GTTAGCTACGGCACTAAAAGG Acc-ppk1-763f GACGAAGAAGCGGTCAAG Acc-IA 408 95 ℃ 3 min; 45 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 61 ℃, 30 s at 72 ℃[17] Acc-ppk1-1170r AACGGTCATCTTGATGGC Acc-ppk1-893f AGTTCAATCTCACCGAGAGC Acc-IIA 105 95 ℃ 3 min; 45 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 61 ℃, 30 s at 72 ℃[17] Acc-ppk1-997r GGAACTTCAGGTCGTTGC Acc-ppk1-870f GATGACCCAGTTCCTGCTCG Acc-IIB 133 95 ℃ 3 min; 45 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 61 ℃, 30 s at 72 ℃[17] Acc-ppk1-1002r CGGCACGAACTTCAGATCG Acc-ppk1-254f TCACCACCGACGGCAAGAC Acc-IIC 207 95 ℃ 3 min; 45 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 66 ℃, 30 s at 72 ℃[17] Acc-ppk1-460r CCGGCATGACTTCGCGGAAG Acc-ppk1-1123f GAACAGTCCGCCAACGACC Acc-IIC (ppk1 excludingOTU NS D3) 254 95 ℃ 3 min; 45 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 63 ℃, 30 s at 72 ℃[17] Acc-ppk1-1376r ACGATCATCAGCATCTTGGC Acc-ppk1-375f GGGTATCCGTTTCCTCAAGCG Acc-IID 148 95 ℃ 3 min; 45 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 63 ℃, 30 s at 72 ℃[17] Acc-ppk1-522R GAGGCTCTTGTTGAGTACACGC Acc-ppk1-355f CGAACTCGGCGAAAGCGAGTA Acc-IIF 246 95 ℃ 3 min; 35 cycles of 30 s of 94 ℃,
45 s at 70 ℃, 30 s at 72 ℃[18] Acc-ppk1-600R ATCGCCTCCGAGCAACTGTTC
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[1] LIU T K, CHEN P, CHEN H Y. Comprehensive assessment of coastal eutrophication in Taiwan and its implications for management strategy[J]. Mar Pollut Bull, 2015, 97(1/2):440-450. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=0159acf9c73298de0a7e1325ba1669e9
[2] BARNARD J L. Biological nutrient removal without addition of chenicals[J]. Water Research, 1975, 9(5/6):485-490. https://www.researchgate.net/publication/229974133_Beckton_Demonstration_Biological_Nutrient-Removal_Plant
[3] NAKAMURA K, HIRAISHI A, YOSHIMI Y, et al. Microlunatus phosphovorus gen-nov, sp-nov, a new gram-positive polyphosphate-accumulating bacterium isolated from activated-sludge[J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1995, 45(1):17-22. doi: 10.1099/00207713-45-1-17
[4] HIEN T T N, VANG Q L, HANSEN A A, et al. High diversity and abundance of putative polyphosphate-accumulating Tetrasphaera-related bacteria in activated sludge systems[J]. Fems Microbiology Ecology, 2011, 76(2):256-267. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=1e7872bad9fe856cd4e28c3e824cae4f
[5] SEVIOUR R J, KRAGELUND C, KONG Y, et al. Ecophysiology of the actinobacteria in activated sludge systems[J]. Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology, 2008, 94(1):21-33. doi: 10.1007/s10482-008-9226-2
[6] COATS E R, WATKINS D L, BRINKMAN C K, et al. Effect of anaerobic HRT on biological phosphorus removal and the enrichment of phosphorus accumulating organisms[J]. Water Environment Research, 2011, 83(5):461-469. doi: 10.2175/106143010X12851009156402
[7] MIELCZAREK A T, HIEN T T N, NIELSEN J L, et al. Population dynamics of bacteria involved in enhanced biological phosphorus removal in Danish wastewater treatment plants[J]. Water Research, 2013, 47(4):1529-1544. doi: 10.1016/j.watres.2012.12.003
[8] HESSELMANN R, WERLEN C, HAHN D, et al. Enrichment, phylogenetic analysis and detection of a bacterium that performs enhanced biological phosphate removal in activated sludge[J]. Systematic and Appiled Microbiology, 1999, 22(3):454-465. doi: 10.1016/S0723-2020(99)80055-1
[9] KEENE N A, REUSSER S R, SCARBOROUGH M J, et al. Pilot plant demonstration of stable and efficient high rate biological nutrient removal with low dissolved oxygen conditions[J]. Water Research, 2017, 121:72-85. doi: 10.1016/j.watres.2017.05.029
[10] WELLES L, ABBAS B, SOROKIN D Y, et al. Metabolic response of "Candidatus Accumulibacter Phosphatis" Clade Ⅱ C to changes in influent P/C ratio[J]. Frontiers In Microbiology, 2017, 7:2121. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28111570/
[11] PETERSON S B, WARNECKE F, MADEJSKA J, et al. Environmental distribution and population biology of Candidatus Accumulibacter, a primary agent of biological phosphorus removal[J]. Environmental Mcirobiology, 2008, 10(10):2692-2703. doi: 10.1111/j.1462-2920.2008.01690.x
[12] GEBREMARIAM S Y, BEUTEL M W, CHRISTIAN D, et al. Research advances and challenges in the microbiology of enhanced biological phosphorus removal-a critical review[J]. Water Environment Research, 2011, 83(3):195-219. doi: 10.2175/106143010X12780288628534
[13] MAO Y, GRAHAM D W, TAMAKI H, et al. Dominant and novel clades of Candidatus Accumulibacter phosphatis in 18 globally distributed full-scale wastewater treatment plants[J]. Scientific Reports, 2015, 5:11857. doi: 10.1038/srep11857
[14] 国家环境保护总局.水和废水监测分析方法[M]. 4版.北京:中国环境科学出版社, 2002:38-47. [15] CROCETTI G R, HUGENHOLTZ P, BOND P L, et al. Identification of polyphosphate-accumulating organisms and design of 16S rRNA-directed probes for their detection and quantitation[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(3):1175-1182. doi: 10.1128/AEM.66.3.1175-1182.2000
[16] FERRIS M J, MUYZER G, WARD D M. Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA-defined populations inhabiting a hot spring microbial mat community[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(2):340-346. http://d.old.wanfangdata.com.cn/OAPaper/oai_pubmedcentral.nih.gov_167804
[17] HE S, GALL D L, MCMAHON K D. "Candidatus Accumulibacter" population structure in enhanced biological phosphorus removal sludges as revealed by polyphosphate kinase genes[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(18):5865-5874. doi: 10.1128/AEM.01207-07
[18] ONG Y H, CHUA A S M, FUKASHIMA T, et al. High-temperature EBPR process:the performance, analysis of PAOs and GAOs and the fine-scale population study of Candidatus "Accumulibacter phosphatis"[J]. Water Research, 2014, 64:102-112. doi: 10.1016/j.watres.2014.06.038
[19] GARCIA M H, IVANIVA N, KUNIN V, et al. Metagenomic analysis of two enhanced biological phosphorus removal (EBPR) sludge communities[J]. Nature Biotechnology, 2006, 24(10):1263-1269. doi: 10.1038/nbt1247
[20] KLAPPENBACH J A, SAXMAN P R, COLE J R, et al. Rrndb:the ribosomal RNA operon copy number database[J]. Nucleic Acids Res, 2001, 29(1):181-184. doi: 10.1093/nar/29.1.181
[21] GUIASAOLA A, QURIE M, DEL MAR VARGAS M, et al. Failure of an enriched nitrite-DPAO population to use nitrate as an electron acceptor[J]. Process Biochenistry, 2009, 44(7):689-695. doi: 10.1016/j.procbio.2009.02.017
[22] LEAL C, AMARAL A L, COSTA M D L. Microbial-based evaluation of foaming events in full-scale wastewater treatment plants by microscopy survey and quantitative image analysis[J]. Environmental Science and Pollupion Research, 2016, 23(15):15638-15650. doi: 10.1007/s11356-016-6750-x
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